抗体制备(抗体制备的一般流程图)

本篇文章给大家谈谈抗体制备,以及抗体制备的一般流程图对应的知识点,希望对各位有所帮助,不要忘了收藏本站喔。 本文目录一览: 1、抗体的制备方法有哪些 2、...

本篇文章给大家谈谈抗体制备,以及抗体制备的一般流程图对应的知识点,希望对各位有所帮助,不要忘了收藏本站喔。

本文目录一览:

抗体的制备方法有哪些

免疫途径有多种多样,如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等,一般常用皮下或背部多点皮内注射,每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性,如激素、酶、毒素等生物学活性抗原,一般不宜采用静脉注射。家兔是最常用以产生抗体的动物,因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以颈静脉、动脉取血,鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法,一是耳缘静脉或耳动脉放血,一是颈动脉入血,也可心脏采血。取动脉或静脉放血时,将兔放入一个特造的木匣或笼内,耳露于箱(笼)外,也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛,用少许二甲苯涂抹耳廓,30s后,耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖,以单面剃须刀或尖的手术刀片,快速切开动脉或静脉,血液即流出,每次可收集30~40ml。然后用棉球压迫止血,凝血后洗去二甲苯。二星期后,可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放血时,将兔仰卧,固定于兔台,剪去颈部的毛,切开皮肤,暴露颈动脉,插管,放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。

收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃下,过夜(切勿冰冻)析出血清,离心,4000rpm,10min。在无菌条件,吸出血清,分装(0.05~0.2ml),贮于-40℃以下冰箱,或冻干后贮存于4。C冰箱保存。

多克隆抗体的制作步骤用疫苗制备抗体,剂量怎么算

一、多克隆抗体的制备一般包括以下几个步骤:

1、制备抗原。

2、选择实验动物。

3、动物免疫。

4、试取血进行测试,看看是否成功免疫。

5、如果成功免疫,杀死实验动物,采集全部血清。

6、纯化出抗体。

7、鉴定抗体。包括纯度以及特异性。

二、抗体分类

抗原通常是由多个抗原决定簇组成的,由一种抗原决定簇刺激机体,由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体(Monoclone antibody)。由多种抗原决定簇刺激机体,相应地就产生各种各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体,机体内所产生的抗体就是多克隆抗体;除了抗原决定簇的多样性以外,同样一类抗原决定簇,也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。多克隆抗体是由异源抗原(大分子抗原、半抗原偶联物)刺激机体产生免疫反应,有机体浆细胞分泌的一组免疫球蛋白。多克隆抗体由于其可识别多个抗原表位、可引起沉淀反应,制备时间短,成本低的原因广泛应用于研究和诊断方面。

三、免疫方法

可以采用以下各种方法之一进行免疫。

(1)淋巴结注射法:①在兔的两后足跖部皮下(或皮内)注射活卡介苗 50mg(每侧约0.30ml) 。7~10 天后,兔跖及腘肌淋巴结肿大;②于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG 乳化抗原 0.50ml(含 IgG 5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素 1 000μg/ml);③必要时,14 天后,重复步骤②一次;④再过 7 天后,于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的 IgG 乳化抗原0.50ml(含IgG5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素 1 000μg/ml) ;⑤5~7天后,耳静脉采血。测定血清效价。

(2)皮下多点注射法:①家兔两侧掌(跖内各注射含有完全佐剂抗原 0.10ml(IgG 含量5mg/ml) ;②7~10 天后,脊柱两侧多点(颈、胸、腰椎各两点、共 6 点)皮下注射含不完全佐剂5的抗原,每点 0.50ml;③7~10 天后,脊柱两侧重复注射一次;④7~10 天后试血。不合格者重复步骤③。

(3)多途径联合注射法:①两侧掌(跖)内侧皮下注射含完全佐剂抗原 0.50ml(IgG 量为 5mg/ml) ;②14 天后,多点皮下注射含有不完全佐剂抗原;③7 天后,耳静脉注射不含佐剂的抗原 2ml;④测定血清抗体效价,不合格者重复步骤③,并适当递增 IgG 量。

单克隆抗体制备的基本过程是什么样的?

单克隆抗体的制备,是克隆技术结合于生物制药领域的一种体现。单克隆体抗体的制备过程,就是通过对实验体的培养和筛选,提炼出单克隆抗体的生物实验。

举措建议

1、对实验体注射抗原体蛋白,使实验体具有抗性。

2、将实验体细胞提取并且在培养基中进行筛选试验。

3、在培养基中,只会选择不亲本的融合细胞,得出初步的单体细胞。

4、将单体细胞在体外进行繁殖培养,得出单克隆抗体。

抗体制备时如何设计理想的免疫原?

在抗体制备过程中,免疫原是影响抗体质量的最重要因素之一。

Ø 首先确认序列并通过访问NCBI等多个数据库来检索相关信息;

Ø 运用多种专业软件,评估稀有密码子、蛋白表达状态对抗体制备的影响,综合分析蛋白的保守结构域、特异性、B细胞线性表位、信号肽、跨膜结构域、亲水性等多种属性,初步筛选合适的抗原区域;

Ø 针对相关基因组/蛋白质数据库进行高级BLAST,进一步筛选候选抗原序列,以避免不期望的序列同源性并使潜在的抗体交叉反应性最小化;

Ø 必要时进行同源物/直系同源物/同种型的多重蛋白比对;

Ø 查找相关文献,是否有相关参考序列;

Ø 根据制备抗体的相关经验,最终确定设计抗原的理想区域。

像ABclonal,多年来一直专注于抗体平台与蛋白平台建设,不断引进先进的抗体和蛋白技术优化两大平台。

抗体的制备有哪些?

(1)多克隆抗体的制备。

①免疫方法:对多克隆抗体,免疫方法一般有皮下或肌肉免疫法、皮内免疫法、淋巴结免疫法和混合法等。一般来说,皮下或肌肉免疫法产生的抗体比较多;皮内免疫法所需的抗原量少,在抗原宝贵时特别适用,但与之相对的,它产生的抗体量也不多。混合免疫法的优点是抗原用量小,产生抗体速度快。

②多克隆抗体的制备:将抗原免疫动物(常用的动物为兔、羊、狗等),分离出抗血清并纯化抗体。多克隆抗体的均一性较差,其特异性相对较低,因此,多克隆抗体在农药残留速测技术中的应用受到一定的限制。但近年来有学者恰恰利用了多抗的交叉反应高的特点,通过制备出具有某类(或某几种)农药的“共性结构”的半抗原或者通过制备出含多个抗原决定簇的人工抗原来制备“宽谱特异性”抗体,进行农药多残留分析研究。

(2)单克隆抗体的制备。单克隆抗体制备技术最初是由K鰄ler和Milstein(1975)利用B淋巴细胞杂交瘤技术创立的。目前该技术已广泛应用于疾病诊断及生物、医学研究、环境和食品安全检测(监测)等方面。单抗均一性高,只和抗原某一决定簇结合,有更高的特异性,而且,产生抗体的单克隆细胞可在体外传代繁殖,不受动物免疫时间限制生产抗体。只要管理和培养技术正确,抗体就可无限量的产生。基本过程是动物免疫、细胞融合、克隆筛选、单克隆抗体性质鉴定、腹水诱发、收集和纯化等。

(3)重组抗体的制备。近年来,随着蛋白质技术及DNA重组技术的发展,人们通过对抗体产生的基因本质、基因重组抗体筛选技术和直接定位诱导基因操纵技术的研究,获得用于指定空间位置并具有各种特异性、亲和性,能忍受一定温度、pH和有机溶剂的人工重组抗体。一般是将抗原免疫小鼠,一定时间后无菌条件下取出小鼠脾脏,提取脾细胞总RNA,以RNA逆转录合成的cDNA为模板,PCR扩增抗体,将抗体中的轻链、重链连接成ScFv(single-chainvariablefragment)。酶切经PCR扩增的ScFv片段,并与噬菌体载体连接,然后以常规方法转化入大肠杆菌或其他生物体中。人工培养带有噬菌体抗体的大肠杆菌,即得到重组抗体。该方法生产抗体速度快,可通过诱变改变抗体特性,使抗体的特异性更强,而且,利用这项技术获得的噬菌体抗体库,能同时识别多种农药,可用于农药多残留免疫速测技术的研究。

单克隆抗体的制备步骤

过程

1)免疫脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备,也可采用脾内直接免疫法。

2)骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前,骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选,防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性(恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活)。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养,融合前24h换液一次,使骨髓瘤细胞处于对数生长期。

3)细胞融合的关键:

1技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

2融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。

4)阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测,过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质,以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便,RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次,均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。

5)克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的,有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多,而最常用的是有限稀释法。

(1)显微操作法:在显微镜下取单细胞,然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂,效率低,故不常用。

(2)有限稀释法:将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后,按每孔1个细胞接种在培养皿中,细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化,所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2~3次的再克隆才成。应该注意的是,每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存,以便重复检查,避免丢失有意义的细胞。

(3)软琼脂法:将杂交瘤细胞稀释到一定密度,然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动,彼此互不相混,从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。

(4)荧光激光细胞分类法:用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞,然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞,并进行单细胞培养。

6)细胞的冻存与复苏

7)大规模单克隆抗体的制备 选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,因为融合细胞随培养时间延长,发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法,即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠,先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集5~10ml的腹水,有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化。

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